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水相比例在HILIC模式下對(duì)分離有何影響?

2022-08-24

HILIC模式中洗脫調(diào)整方向

洗脫原理主要是極性相似相容和親水分離分配模式,洗脫時(shí)極性強(qiáng)的溶劑越多,保留時(shí)間越短;出峰順序是極性弱的先出,極性強(qiáng)的后出,與反相相反,因此適合保留極性強(qiáng),在反相上無法保留的物質(zhì)。

實(shí)例

CTP、ATP、GTP、UTP的分離:

ATP:三磷酸腺苷

GTP:三磷酸鳥苷

CTP:胞嘧啶核苷三磷酸

UTP:三磷酸尿苷 

Ultimate? AQ-C18 4.6*250mm 5μm  磷酸鹽緩沖液(pH呈中性)-乙腈體系,梯度運(yùn)行見下表:

微信截圖_20220824162528.png

效果圖

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分析:各峰分離良好,但出峰均在純鹽相段出峰,保留弱,部分目標(biāo)峰的峰型不好,方法重現(xiàn)性不好,易與溶劑峰重合。

根據(jù)HILIC的作用原理,該模式適合這類極性物質(zhì)的分離,故Topsil? Silica 4.6*250mm 5μm:

磷酸鹽-乙腈(25/75)

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分析:  四種物質(zhì)分離完全,保留適中,但有雜質(zhì)峰干擾風(fēng)險(xiǎn),峰形有可以優(yōu)化的空間,減少水相,延長(zhǎng)保留。

磷酸鹽-乙腈(20/80)

微信截圖_20220824162622.png

分析:分離良好,峰形改善,雜質(zhì)無干擾,各目標(biāo)峰保留增強(qiáng)很多,一針運(yùn)行時(shí)間較長(zhǎng),流動(dòng)相中水相比例對(duì)保留與分離影響較大,與HILIC的分離原理符合,水相為強(qiáng)洗脫能力項(xiàng),微小比例的改變對(duì)色譜效果影響大,水相比例減小。

磷酸鹽-乙腈(22/78)

微信截圖_20220824162628.png

分析:與預(yù)期相一致,保留時(shí)間縮短,與雜質(zhì)能較好分離,可以嘗試梯度,在HILIC模式中水相的微小變化對(duì)色譜圖影響大,因此兩針之間的平衡時(shí)間建議在10倍柱體積以上,而且平衡時(shí)間一致,也可以讓系統(tǒng)達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡,以保證分離效果的重現(xiàn)。

結(jié)論

運(yùn)行HILIC模式時(shí):

1. 考慮樣品極性和溶解性:首先目標(biāo)一般是強(qiáng)極性物質(zhì),且更好是在高比例有機(jī)相中有一定溶解性,如果樣品在有機(jī)相中不溶或溶解度很低,或容易產(chǎn)生其他反應(yīng)的,則不適用;

2. 考慮緩沖鹽與有機(jī)相的互溶性:調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例時(shí),如果流動(dòng)相中含鹽,要考慮鹽在有機(jī)相中的溶解度,避免出現(xiàn)鹽析等現(xiàn)象;

3. 關(guān)注系統(tǒng)真正的平衡狀態(tài):系統(tǒng)平衡不僅僅是關(guān)注基線噪音和漂移的問題,是連續(xù)進(jìn)樣獲得穩(wěn)定的保留時(shí)間和峰面積,測(cè)試過程中會(huì)碰到系統(tǒng)平衡慢的問題,需要附上解決或改善方法;

4. 關(guān)注樣品的穩(wěn)定性:確保所使用的樣品溶液是更接近初始狀態(tài)的,測(cè)試過程中需關(guān)注溶液穩(wěn)定狀態(tài),必要時(shí)臨用新制;根據(jù)整個(gè)方法時(shí)樣品的主峰情況確定更終的配制方法和保存方法。

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