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考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

2022-02-07

考馬斯藍(lán)染色法又稱Bradford法,是Bradford于1976年建立起來(lái)的一種蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定方法??捡R斯亮藍(lán)G-250測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。在游離狀態(tài)下呈紅色,更大光吸收在488nm;當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?,蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有大光吸收。

實(shí)驗(yàn)儀器

分析天平、燒杯、玻璃杯、移液槍、紫外分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀。

實(shí)驗(yàn)試劑

標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液:常用牛血清蛋白(BSA),配制1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

0.01%考馬斯亮藍(lán)染色液G-250:稱取0.01g考馬斯亮藍(lán)G-250,溶于95%乙醇中,加85%(m/V)的磷酸10mL,后用超純水定容至100mL,裝入棕色瓶中保存。(不宜久存,室溫1-2個(gè)月)

實(shí)驗(yàn)步驟

紫外分光光度計(jì)測(cè)定

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將表格所示溶液加入試管中充分混勻,10min后倒入比色皿,放入紫外分光光度計(jì)于595nm測(cè)定吸光值,1號(hào)管作為空白對(duì)照,以蛋白濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)曲作為定量依據(jù)。

②樣品測(cè)定

取含10-100μL蛋白質(zhì)溶液于小試管中,加水稀釋至0.1mL,然后加入5mL G-250蛋白染色液,充分混勻,10min后倒入比色皿,放入紫外分光光度計(jì)于595nm測(cè)定吸光值,1號(hào)管作為空白對(duì)照,將測(cè)得吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的蛋白質(zhì)含量。

酶標(biāo)儀測(cè)定

微信截圖_20220207163052.png

將表格所示溶液依次加入酶標(biāo)板中混勻,靜置10min后,放入酶標(biāo)儀中于595nm測(cè)定吸光值,A孔作為空白對(duì)照,以蛋白濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)曲作為定量依據(jù)。

②樣品測(cè)定

取含4-40μL蛋白質(zhì)溶液于酶標(biāo)板中,加水稀釋至40μL,然后加入250μL G-250蛋白染色液,充分混勻,靜置10min后,放入酶標(biāo)儀于595nm測(cè)定吸光值,A孔作為空白對(duì)照,將測(cè)得吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的蛋白質(zhì)含量。

注意事項(xiàng)

通常會(huì)將樣品稀釋多個(gè)梯度進(jìn)行測(cè)定,防止樣品測(cè)得吸光值過(guò)高,超出標(biāo)曲導(dǎo)致的含量計(jì)算偏差。

樣品中若含有去污劑,如TritonX-100、SDS等,會(huì)嚴(yán)重干擾測(cè)定結(jié)果。

比色反應(yīng)需在1h內(nèi)完成,如果測(cè)定要求很嚴(yán)格,可以在染色液加入后的5-20min內(nèi)測(cè)定吸光值,因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是穩(wěn)定的。

測(cè)定時(shí),蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附在比色皿杯壁上,測(cè)試完后可用乙醇溶液將比色皿中的殘留物沖洗掉,再用超純水沖洗干凈保存。

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