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#1 色譜柱的技術(shù)都有哪些？比如，封尾等，這些技術(shù)在應(yīng)用時都體現(xiàn)在哪里？

答：色譜柱技術(shù)包括填料技術(shù)，封尾技術(shù)和裝柱技術(shù)等，填料技術(shù)自不待言，填料的差異對色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響，色譜填料的鍵合相密度的不同也會影響到填料表面硅羥基裸露的多少，進(jìn)而影響填料的選擇性。封尾技術(shù)中用到的封尾試劑的差異也會對色譜柱的性質(zhì)產(chǎn)生很大的影響，如體現(xiàn)在色譜填料的pH耐受范圍，水相耐受范圍，極性強弱等。裝柱技術(shù)也沒有想象中的這么簡單，不同固定相、不同粒徑、不同柱管內(nèi)徑和長度，裝柱工藝都有所不同，要裝出緊密、穩(wěn)定、均一的柱床，更多是一門藝術(shù)，需要經(jīng)驗積累。

#2 柱子在什么情況下需要更換篩板呢？更換篩板會使色譜柱使用壽命減少嗎？

答：色譜柱篩板被樣品污染，或被柱頭端填料污染了，就需要更換篩板，并且更換柱頭端被污染的填料。月旭科技不建議客戶自行拆開色譜柱柱頭螺絲，更好是寄回廠家維修。色譜柱更換篩板和柱頭填料不會對色譜柱使用壽命造成影響。

#3 如果柱子取下來放置一段時間，需要做什么保護(hù)嗎？

答：對一般的反相柱，也就是洗干凈后置于純甲醇（乙腈）或者是80%左右的甲醇（乙腈）水中，然后用堵頭塞緊柱兩頭，以免保存溶劑揮發(fā)，下次使用前拿出來重新活化一下。

#4 做實驗，是用保護(hù)柱好？還是不用保護(hù)柱好？

答：應(yīng)該這樣說，加上保護(hù)柱，肯定有利于保護(hù)色譜柱不受一些顆粒物質(zhì)的堵塞，且如果保護(hù)柱接得好并且盡量控制其匹配性和經(jīng)常更換，對分離度和柱效的影響并不大。只是在選擇保護(hù)柱柱芯時千萬注意，選擇和分析柱填料相一致的保護(hù)柱柱芯，否則極有可能影響化合物的分析。

#5 用的是四元梯度泵：A：50%甲醇；B：50%水，經(jīng)常出現(xiàn)停或進(jìn)氣泡這是什么原因？

答：水/甲醇比例在55/45時，黏度和柱壓有個極大值。50/50接近了這個極值，柱壓是比較高的。但影響柱壓更大的還是填料粒徑和色譜柱內(nèi)徑。系統(tǒng)壓力高，可能會因溶劑泵中的過濾頭供液速度跟不上而導(dǎo)致氣泡進(jìn)入系統(tǒng)，停機也應(yīng)該是因為氣泡進(jìn)入壓力下降的原因，可考慮更換液體通量更大的過濾頭。

#6 填料方法的前三種都是濕法嗎，能不能對四種填充方法做一個簡短的說明？

答：資料顯示：在正常條件下，填料粒度＞20μm時，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20μm時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：

① 高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；

② 徑向加壓法，Waters專L；

③ 軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱，如DAC；

④ 干法柱填充的技術(shù)性很強，大多數(shù)實驗室使用已填充好的商品柱。

#7 如果不使用不銹鋼接頭，而改用peek頭，是否可以完Q解決接頭匹配問題？

答：色譜柱接頭其實大都不是色譜柱廠商自己生產(chǎn)的，供貨商有多個，Valco，Parker等，他們的標(biāo)準(zhǔn)相互之間不統(tǒng)一，那色譜柱接頭的標(biāo)準(zhǔn)就統(tǒng)一不起來。不過一般這個問題也不難解決的，換個接頭就可以了，而且現(xiàn)在有了萬用接頭，可以配所有不同類型的柱頭，不泄露，連接死體積又很小。

#8 做多肽藥物時，流動相A：0.1%或者1%TFA水溶液，流動相B：0.1%或者1%TFA乙腈溶液，基線波動大，流動相中不加TFA時見不到主峰，基線良好。

答：很明顯這是TFA加入流動相里，走梯度情況下造成的基線波動。TFA優(yōu)于其他離子修飾劑的原因是它容易揮發(fā)，可以方便地從制備樣品中除去。另一方面，TFA的紫外更大吸收峰低于200nm，因此在低波長下容易出現(xiàn)基線干擾。解決辦法可以建議在其中一瓶流動相中等比例加入另一瓶流動相的溶液。

#9 三lv乙酸流動相使用完之后如何沖洗色譜柱比較好？

答：流動相加入TFA，在反相色譜分離多肽和蛋白質(zhì)的實驗中，使用TFA作為離子對試劑是常見的手段。流動相中的TFA通過與疏水鍵合相和殘留的極性表面以多種模式相互作用，來改善峰形、克服峰展寬和拖尾問題。因為TFA也屬于一種離子對試劑，因此更好也使用沖洗離子對試劑的步驟沖洗色譜柱，即50%甲醇水低流速反沖過夜。若是分析蛋白樣品，建議按照10%甲醇--乙腈/水/TFA (50/50/0.1)，低流速反沖過夜。

#10 藥典上介紹測定分子量大于2000的樣品，選擇柱子填料的孔徑為300?，300?與100?對結(jié)果有什么區(qū)別？

答：在做多肽類樣品的時候，300?孔徑的填料相對100?孔徑肯定要選擇性好點，也就是分離度相對比較好點。因為蛋白分子量＞2000，會對進(jìn)入120?填料的孔造成困難，從而進(jìn)不了孔，沒有保留，就在填料表面，隨著溶劑一同出峰。我們一般選擇填料的時候，要求孔徑至少是分子直徑的三倍，從而保證分子可以進(jìn)入到孔內(nèi)。