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各位小伙伴在做蛋白純化時(shí)，是否會(huì)苦惱“誒，我用的填料咋沒(méi)用幾次就不行了呢”。在篩選填料時(shí)會(huì)反復(fù)的考察填料壽命。不過(guò)，各位小伙伴需要留意了，填料壽命短有可能是你在使用蛋白層析填料時(shí)這些因素沒(méi)有考慮周全。

01 重復(fù)裝柱

每次裝柱的過(guò)程都涉及到填料的脫氣處理，及裝填柱床時(shí)的壓縮柱床，然后脫氣時(shí)的超聲或者抽濾都會(huì)對(duì)填料施壓，壓縮柱床也要對(duì)填料施壓，反復(fù)的施壓及壓力控制不當(dāng)也會(huì)使填料的物理性能發(fā)生變化從而影響填料的壽命。

 柱床被嚴(yán)重污染或者進(jìn)氣泡時(shí)，拆裝清洗比CIP效果更好，更有利于填料壽命衰減的降低。

02 樣品狀態(tài)

 a.樣品澄清度：樣品越澄清對(duì)填料的壽命衰減影響越小。

 b.樣品粘度：樣品的粘度越小，對(duì)填料壽命的影響越小。

 c.樣品酸堿度：過(guò)酸過(guò)堿都會(huì)加速填料壽命的衰減。

 d.樣品離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越高填料壽命衰減的越快。

 e.樣品成分組成：樣品成分越復(fù)雜，層析過(guò)程越復(fù)雜，填料的壽命衰減越塊（這也與填料所處的工藝階段吻合，捕獲粗純階段填料壽命衰減的更快，精純階段填料壽命衰減的慢。）

03 層析工藝

a.柱床高度，流速及反壓越大，工藝過(guò)程填料受到的外力就會(huì)增大，填料的壽命衰減就會(huì)增大。

b.層析工藝過(guò)程的緩沖液的種類及洗脫的CV數(shù)也會(huì)影響填料的壽命，緩沖液越溫和對(duì)填料壽命衰減影響越小，洗脫CV數(shù)越小對(duì)填料壽命衰減影響越小。

04 維護(hù)保養(yǎng)

合理的維護(hù)保養(yǎng)過(guò)程可以降低填料壽命的衰減，但是維護(hù)過(guò)程的CIP及消毒過(guò)程通常都需要?jiǎng)×业臈l件，如強(qiáng)酸強(qiáng)堿等，所以CIP的強(qiáng)度及頻率越大對(duì)填料的壽命衰減影響越大。

a.再生：恢復(fù)介質(zhì)原有功能。

b.清洗（CIP)：去除填料中積累的雜質(zhì)及污染物，比再生劇烈。

c.消毒：去內(nèi)毒素及微生物。

d.保存：使用后合理保存（溫度，保存液）。

常見(jiàn)的離子交換層析填料清洗

日常清洗

離子交換樹(shù)脂每次使用后可以用 1M NaCl 甚至更高離子強(qiáng)度溶液或高 pH 溶液清洗，然后用至少 5 倍柱體積的 Buffer 進(jìn)行平衡至離子強(qiáng)度或 pH 值穩(wěn)定。

CIP（Cleaning In Place）清洗

離子交換樹(shù)脂可以重復(fù)使用而無(wú)需再生，但隨著非特異性結(jié)合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和結(jié)合載量都下降，這時(shí)可按照下面方法對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行清洗。

去除一些沉淀或變性物質(zhì)，建議使用下面的方法

用 2 倍柱體積的 1M NaOH 溶液進(jìn)行清洗，然后立即用 5 倍柱體積的 PBS, pH 7.4 清洗。

去除一些疏水性吸附造成的非特異性吸附物質(zhì) 

用 3-4 倍柱體積的 70%乙醇或 3-4 倍柱體積的 1% Triton? X-100 清洗，然后立即用 5 倍柱體積的 PBS, pH 7.4 清洗。

去除一些離子鍵結(jié)合物質(zhì) 

用 3-4 倍柱體積的 2M NaCl 清洗，然后立即用 5 倍柱體積的 PBS, pH 7.4 清洗。